De De Posthoornkerk is de eerste kerk die P.J.H. Cuypers in Amsterdam bouwde Er zouden er nog vijf volgen. De hoge torens van de Posthoornkerk vormen een belangrijke ankerplaats in het stadsbeeld van de Haarlemmerbuurt. Hoewel het gebouw in 1972 op de rijksmonumentenlijst werd geplaatst, heeft zijn voortbestaan lange tijd aan een zijden draadje gehangen. Uiteindelijk heeft de kerk na een restauratie met behulp van het Amsterdamse Monumentenfonds een multifunctionele herbestemming gevonden.
In 1623 stichtten paters Augustijnen een statie (missiepost) in de Haarlemmerbuurt. Aanvankelijk kwamen de gelovigen bijeen in de herberg Het Friesche Wapen, ongeveer ter plekke van Haarlemmerstraat 132. In 1682 betrokken de Augustijnen een huiskerk aan de Prinsengracht 7, in een voormalig onderkomen van de postkoetsdienst naar Haarlem. Daaraan ontleende de kerk haar naam. Boven de deur van het huis prijkt nog een gevelsteen met een posthoorn. De huiskerk was van het gangbare type, met twee gaanderijen boven elkaar. Toen De Posthoorn in 1857 als de parochiekerk voor de Jordaan en de Haarlemmerhouttuinen werd aangewezen, werden er plannen gemaakt voor een nieuw kerkgebouw. Tegen bijbetaling ruilde het kerkbestuur het pand met de huiskerk tegen een aantal panden aan de Haarlemmerhouttuinen en één pand aan de Haarlemmerstraat.
Als voorbeeld stond het kerkbestuur de Romaansgotische Munsterkerk in Roermond voor ogen. P.J.H. Cuypers (1827-1921) die op dat moment de restauratie van de Munsterkerk voorbereidde, werd als architect van de nieuwe kerk gevraagd. Op 24 september 1861 vond de eerste steenlegging plaats, twee jaar later kon de kerk in gebruik worden genomen. Kort daarvoor was de pastorie, Haarlemmerhouttuinen 49, gereedgekomen. De nieuwe kerk werd gewijd aan Onze Lieve Vrouwe Onbevlekt Ontvangen; in de volksmond bleef de kerk De Posthoorn heten.
Ter gelegenheid van het 25-jarig jubileum, werd de kerk in de jaren 1887-1889 naar de Haarlemmerstraat doorgetrokken. Hier kwamen een voorhal met ingangsportaal en twee geveltorens van 64 meter hoogte. Op last van de gemeente was de gevel door een voorplein 12,75 meter van de rooilijn van de straat verwijderd. Het hoge kerkgebouw zou anders te zeer inbreuk doen op de kleinschalige bebouwing in de smalle Haarlemmerstraat. In 1922 werden de torens van luiklokken voorzien die in de Tweede Wereldoorlog zijn verdwenen. In 1948 werden weer drie nieuwe luiklokken geïnstalleerd.
De bundeling van torens, de twee geveltorens en de vieringtoren, vormt nog altijd het herkenningspunt van de Haarlemmerbuurt. Torens speelden ook een grote rol bij de andere Amsterdamse kerkontwerpen van Cuypers. Zo wilde hij van Amsterdam weer een katholieke stad maken waarvan het silhouet, net als bij een middeleeuwse stad, beheerst werd door een krans van kerktorens.
Naar de wens van het kerkbestuur vertoont de Posthoornkerk tal van overeenkomsten met de Munsterkerk te Roermond, zoals het basilikale driebeukige schip, de klaverbladvormige koorpartij, de achthoekige vieringtoren, de blindbogen en rondboogfriezen, en de wijze waarop telkens drie vensters gegroepeerd zijn. Maar er zijn ook verschillen. De hoogtewerking is veel uitgesprokener waardoor de Posthoornkerk, in combinatie met de spitse lancetvensters en bogen, de kruisribgewelven en de luchtbogen een meer uitgesproken gotisch karakter heeft gekregen.
Het interieur laat een afwisseling zien van bundelpijlers waarop de gewelfribben rusten afgewisseld en de ronde zuilen van de arcade. Opvallend zijn de twee gaanderijen boven elkaar in de zijbeuken, een constructie die nog herinneringen oproept aan de oude huiskerk.
Het materiaalgebruik is gevarieerd. De wanden bestaan uit afwisselend rode en gele bakstenen, terwijl de kolommen en kapitelen in zandsteen zijn uitgevoerd. De ondersteunende schalken (kwartzuilen) van de vieringkolommen zijn destijds op last van het gemeentelijk ‘Bouwtoezicht’ uit gietijzer vervaardigd.
Na de ingebruikneming werd de kerk door schenkingen verrijkt met een preekstoel, een hoogaltaar, en een respectievelijk Maria- en St. Augustinusaltaar, alle afkomstig uit het atelier van Cuypers in Roermond. De gebrandschilderde ramen werden vervaardigd door F. Nicolas te Roermond naar ontwerpen van J. Lauweriks. In 1910 schilderde Jan Dunselman de apostelfiguren in de nissen van het dwarsschip. De kruiswegstaties in de zijbeuken werden rond dezelfde tijd geschilderd door A. Kläsener.
De inrichting heeft in de loop der tijd vele wijzigingen ondergaan. Van het oorspronkelijke Cuypers-meubilair rest niets meer. Het hoogaltaar werd in 1933 vervangen door een altaar van K. P. Tholens. In 1940 kwamen nieuwe gebrandschilderde ramen naar ontwerpen van Willem Schermer. Het orgel dat nog van de oude huiskerk afkomstig was, werd in 1928 vervangen door een nieuw exemplaar.
In 1972 werd De Posthoorn op de rijksmonumentenlijst geplaatst. De nieuwe status bleek geen garantie voor behoud. De kerk zou plaats moeten maken voor bejaardenwoningen, maar de toenmalige minister van CRM, Van Doorn, weigerde een sloopvergunning te verlenen. In 1987 werd de Stichting De Posthoorn in het leven geroepen. In samenwerking met het Amsterdams Monumentenfonds stelde ze een plan op voor herbestemming van de kerk om zo een sluitende exploitatie mogelijk te maken. De restauratie en verbouwing werden uitgevoerd onder leiding van de architect A. van Stigt. In de galerijen en in het voorste deel van het middenschip kwamen kantoorruimtes met glazen transparante afscheidingen zodat de oorspronkelijke ruimtewerking zoveel mogelijk behouden bleef. Het grootste deel van de kerk, het middenschip, dwarsschip en koor, biedt ruimte aan een breed scala van culturele evenementen, zoals tentoonstellingen, voorstellingen, concerten en congressen.